收到細胞后，請按照以下方法進行操作。

1. 取出25cm2培養瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO2細胞培養箱中靜置6-8小時或者過夜，以穩定細胞狀態。

2. 待細胞達到80%匯合時準備進行傳代培養。

3. 細胞傳代

1) 吸出25cm2培養瓶中的培養基，用PBS清洗細胞一次；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養瓶中，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入*培養液終止消化；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當的比例進行接種傳代，然后補充新鮮的*培養基至5mL，放入37℃，5% CO2細胞培養箱中培養；

4) 待細胞*貼壁后，培養觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養基。

產品名稱

名稱    小鼠神經少突膠質前體細胞

2.組織來源：腦組織

3.產品規格：5×105cells/T25細胞培養瓶

4.細胞簡介：

小鼠神經少突膠質前體細胞分離自腦皮層組織；大腦分左右兩個半球，大腦皮質（灰質）覆蓋著每個大腦半球的大部分，它是神經元胞體集中的地方。內部則是由神經纖維或髓鞘構成的白質。少突膠質細胞分布于中樞神經系統，在銀浸染標本中，少突膠質細胞比星狀膠質細胞小，其突起也較小而少，呈珠狀，故被稱為少突膠質細胞或寡突膠質細胞。少突膠質細胞（oligodendrocyte）是中樞神經系統（CNS）的成髓鞘神經膠質細胞，其發育要經歷少突膠質細胞祖細胞、前少突膠質細胞祖細胞、未成熟和成熟少突膠質細胞等階段。有學者將少突膠質細胞按其發育程度和形態分為三型。但是，細胞發育是一個連續的過程，其形態、表達產物和功能的演變沒有嚴格的界限，因此，其分類是相對的。這三型分別為：Ⅰ型少突膠質細胞又稱前O2A（pre-O2A progenitor cell）。細胞呈圓形，表面光滑，直徑約3μm，體外混合培養時成簇生長在星形膠質表面，具有很強的分裂增殖潛力，表達神經節苷脂GM1、波形蛋白和多唾液酸—神經粘附分子（polysialic acid-neural cell adhesion molecule，PSA-NCAM）等。Ⅱ型少突膠質細胞胞體常有雙極或三極突起，極少數為單極突起，直徑約7μm，有一定的分裂增殖能力。體外培養時為雙潛能細胞，既可分化為少突膠質細胞又可分化為Ⅱ型星形膠質，故又稱為少突膠質細胞-Ⅱ型星形膠質祖細胞（oligodendrocyte-type-2 astrocyte progenitor cell，O2A）。O2A除表達GM1和波形蛋白外還表達神經節苷脂GD3和GQ（淋巴雜交瘤株A2B5產生GQ的抗體），故常用A2B5抗體標記O2A。Ⅲ型少突膠質細胞不再具有分裂增殖能力，為分裂終期細胞。直徑約10μm。根據其形成髓鞘的能力，又分為不成熟的和成熟的兩類少突膠質細胞。不成熟的OL胞體常伸出4～5條較粗大突起，表面還殘留有A2B5標記物，同時也表達O1-O4抗原，無形成髓鞘的能力。成熟的少突膠質細胞突起有如蜘蛛網，大量表達半乳糖腦苷脂（galactocerebro side，GC）、蛋白脂蛋白（proteio lipid protein，PLP）、髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）等，有對軸突髓鞘化的能力。體外培養的少突膠質細胞前體細胞（簡稱少突膠質細胞前體細胞）包括前O2A和O2A和未成熟少突膠質細胞，前兩者具有增殖能力。

5.方法簡介：

實驗室分離的小鼠神經少突膠質細胞采用胰蛋白酶消化、混合細胞營養缺失培養、搖床振蕩結合差速貼壁法并通過專用培養基培養篩選制備而來，細胞總量約為5×105cells/瓶。

6.質量檢測：

實驗室分離的小鼠神經少突膠質前體細胞經A2B5免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

7.培養信息：

包被條件PLL（0.1mg/ml）

培養基含B-27 Supplement、PDGF、bFGF、Penicillin、Streptomycin等

產品貨號CM-M308

換液頻率每2天半量換液1次

生長特性貼壁

細胞形態雙極、多極形

傳代特性不傳代，不增值，存活1-2周

消化液0.25%胰蛋白酶

培養條件氣相：空氣，95%；CO2，5%

產品特點:

1、 使用方便:不需昂貴設備。

2、 可以處理各種細菌菌體，包括新鮮菌液和冰凍菌體。

3、 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時。

4、 采用溫和的中性裂解組分，保持蛋白活性。

5、 含蛋白穩定劑，提取的蛋白穩定。

6、 紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。

7、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等。

8、 本試劑盒中不有EDTA，與金屬螯和層析等兼容。

細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養基的培養瓶中培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。

4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

一、凍存時的注意事項：

1. 在冷凍保存之前，應觀察細胞生長是否良好(log phase) 且存活率高，凍存的細胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測細胞是否保有其*性質，例如是否有雜細胞或者支原體等。

3. 使用的DMSO 應為試劑級等級，以5~10 ml 小體積分裝，4 度避光保存，勿作多次解凍。使用的甘油也應為試劑級等級，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。

4. 冷凍保存的細胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細胞: 1~3 x 10^6 cells/ml，細胞濃度不要太高，某些雜交瘤會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后。

4-3.貼壁腫瘤細胞: 1 x 10^6，依細胞種類而異。腺癌類的細胞解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml。

4-4. 懸浮細胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細胞須至少5 x 10^6 cells/ml。

5. 冷凍保護劑濃度為5 %或10 ％ DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。